У чому полягає техніка микроскопирования забарвлених препаратів. Удосконалення мікроскопа і розвиток мікроскопічної техніки на початку XX століття. Виявлення біополімерів в біологічних об'єктах
Ознайомлення з микроскопированием мазків.
Для вивчення морфології мікроорганізмів використовують мікроскопи. Біологічний мікроскоп (рис. 1) являє собою оптичний прилад, Що збільшує предмети в 1000-15000 разів, і складається з механічної, оптичної та освітлювальної систем.
До механічної системи належать подковообразная ніжка, тубусодержатель, тубус, предметний столик, гвинти. Оптична система включає об'єктиви і окуляр. Освітлювальна система складається з конденсора з діафрагмою і дзеркала.
Тубусодержатель і подковообразное підставу (ніжка) з'єднані між собою рухливо шарніром. тубус - зорова труба мікроскопа. У верхню частину тубуса вставлений окуляр, в нижню - обертається навколо своєї осі револьвер, в який угвинчені об'єктиви. Тубус пересувається вгору і вниз за допомогою макрометріческого і мікрометричного гвинтів. Один оборот мікрометричного гвинта пересуває тубус на 0,1 мм. Тому мікрогвинти користуються для більш точного наведення, а для попередньої - макровінтом. Предметний столик призначений для розміщення досліджуваного матеріалу. Столик можна пересувати в різних напрямках за допомогою гвинтів.
Конденсор складається з лінз, що збирають відбиті від дзеркала промені в сильний світловий пучок, і направляє його через отвір предметного столика на препарат. При визначенні рухливості нефарбованих препаратів конденсор повинен бути кілька опущений.
Діафрагма знаходиться між дзеркалом і конденсором і служить для регулювання кількості світла, що надходить в конденсор.
Об'єктив складається з системи лінз, укладених в металеву оправу. Передня лінза служить для збільшення предмета, інші - для корекції зображення. Об'єктив дає дійсне, збільшене, зворотне зображення.
Сучасні біологічні мікроскопи мають не менше трьох об'єктивів. Сухі об'єктиви збільшують в 8 і 40 раз (між об'єктивами і препаратом знаходиться шар повітря), імерсійним - в 90 разів. На оправу кожного об'єктива нанесена цифра, яка вказує збільшення. При мікроскопії забарвлених препаратів користуються іммерсійним об'єктивом, занурюючи передню лінзу в краплю кедрової олії, нанесеного на предметне скло з пофарбованими бактеріями. Завдяки цьому всі промені від освітлювача, не змінюючи свого напрямку, потрапляють в об'єктив і виходить чітке зображення.
Окуляр складається з верхньої - очної і нижньої - збиральної лінз. На верхній частині окуляра є цифра, яка вказує збільшення (7, 10, 15). Окуляр збільшує тільки зображення. Загальне збільшення мікроскопа складається з твору збільшення об'єктива на збільшення окуляра.
Принцип дії люмінесцентного мікроскопа заснований на здатності окремих об'єктів і барвників світитися при освітленні їх ультрафіолетовими променями. Люмінесцентні мікроскопи забезпечені джерелом ультрафіолетового світла і набором світлофільтрів. У бактерій дуже слабо виражена власна флюоресценція. Тому необхідно їх обробити флюоресцирующими фарбами (флюорохромами), які забарвлюють структурні "елементи клітини в різні кольори.
Принцип дії електронного мікроскопа заснований на використанні замість світлових променів потоку електронів, що отримуються з електронної гармати. Всі оптичні лінзи замінені електромагнітними котушками, що створюють електромагнітне поле, яке управляє рухом електронів. Електронний мікроскоп збільшує предмет в 50-200 тис. Раз. Препарати для дослідження готують на тонких плівках коллодия. На шляху потоку електронів ставлять досліджуваний об'єкт, який відбивається на люминесцирующий екрані. Зображення об'єкта можна сфотографувати апаратом, вмонтованим в мікроскоп. За допомогою електронної мікроскопії можна детально вивчати будову бактерій, вірусів, бактеріофага.
Робочий стіл для микроскопирования препаратів бажано розміщувати біля вікна. Мікроскоп встановлюють на робочий стіл тубусодержатель до себе приблизно на 7-10 см від краю. Спочатку проводять настройку освітлення, для чого дзеркалом направляють пучок світла від джерела освітлення в об'єктив зі збільшенням в 8 разів.
При правильному налаштуванні освітлення поле зору мікроскопа повинно бути у вигляді рівномірно освітленого кола. Після цього на предметний столик поміщають досліджуваний препарат, який закріплюють клемами і розглядають під мікроскопом, користуючись об'єктивами зі збільшенням в 8, 40 або 90 разів.
При роботі з об'єктивами 8 і 40 тубус мікроскопа обережно опускають за допомогою макрометріческого гвинта, наближають об'єктив майже впритул до препарату, але не стосуються його. Спостерігають в окуляр, злегка піднімаючи тубус тим же гвинтом до отримання зображення. За допомогою мікрометричного гвинта проводять точну установку об'єктива до отримання чіткого зображення предмета.
При роботі з іммерсійним об'єктивом (збільшення в 90 разів) на препарат попередньо наносять краплю иммерсионного масла, а потім під контролем очі макрометріческім гвинтом опускають об'єктив в краплю олії. Точну установку препарату в фокус об'єктива проводять за допомогою мікрометричного гвинта, який можна обертати на півоберта.
Після закінчення роботи досліджуваний матеріал знімають з предметного столика. М'якою тканиною, змоченою в спирті або ефірі, видаляють іммерсійне масло з об'єктива, злегка опускають конденсор, встановлюють об'єктив і прибирають мікроскоп в футляр або зберігають його під скляним ковпаком, що оберігає його від пилу і вогкості.
Заклад освіти
Лабораторна робота №1
перевірив
ст.викладач
____________ Тітенкова Н. І.
«__» _________ 2011
виконала
Студентка групи ТЕТ-101
____________ Лобкова М. Ю.
«__» _________ 2011
Могильов 2011
Міністерство освіти Республіки Білорусь
Заклад освіти
МОГИЛЕВСЬКИЙ державний університет продовольства
КАФЕДРА «ТЕХНОЛОГІЇ ХАРЧОВИХ ВИРОБНИЦТВ»
Мікробіологічна лабораторія. Мікроскоп і техніка микроскопирования
Лабораторна робота №1
Спеціальність 1-25010901 «Товарознавство та експертиза продовольчих товарів»
перевірив
ст.викладач
____________ Тітенкова Н. І.
«__» _________ 2011
виконала
Студентка групи ТЕТ-101
____________ Шевцова Е. Н.
«__» _________ 2011
Могильов 2011
Лабораторна робота № 1.
Мікробіологічна лабораторія. Мікроскоп і техніка микроскопирования
мета: Ознайомлення студентів з призначенням, пристроєм, обладнанням і режимом роботи мікробіологічної лабораторії; освоєння техніки мікроскопії мікробіологічних препаратів.
Контрольні питання:
- Призначення мікробіологічної лабораторії, її влаштування і обладнання.
Мікробіологічні дослідження здійснюються в спеціальних приміщеннях, званих мікробіологічної лабораторії. До складу мікробіологічної лабораторії входять кілька приміщень:
1 - лабораторна кімната для досліджень;
2 - кімната для приготування поживних середовищ;
3 - кімната для миття посуду (мийна);
4 - кімната для стерилізації посуду, поживних середовищ
(Стерилізаційна);
5 - бокс - ізольована кімната для проведення робіт, що вимагають підвищеного ступеня стерильності. Для цього перед роботою повітря та інші предмети, що знаходяться в ньому, знезаражуються.
устаткування мікробіологічної лабораторії
До обладнання мікробіологічної лабораторії відносяться прилади оптичні (мікроскопи, лупи), прилади термічні (термостати, автоклави, апарати Коха, сушильні шафи, холодильники, мікробіологічні (бактеріологічні голки, петлі, шпателі) і хірургічні інструменти (скальпелі, пінцети, власники, ножиці), а також пробірки, чашки Петрі, покривні і предметні скельця, скляні трубочки, крапельниці з барвниками. В лабораторії необхідна наявність поживних середовищ (сухий поживний агар, середа Кесслер, середа Ендо), агар-агар, желат ина, аналінових барвників (фуксин, генціанвіолет, метиленовий синій, метиленовий блакитний), різні кислоти, луги, сода.
Малюнок 1 - Мікробіологічна посуд: а- чашка Петрі; б-скло предметне; в- стекло покривне; г-голка мікробіологічна; д петля мікробіологічна; е-шпатель Дрігальского.
- Як повинно бути обладнане робоче місце мікробіолога?
- Які існують методи мікробіологічних досліджень і які з них застосовуються для мікробіологічного аналізу харчових продуктів?
- бактеріоскопічне (мікроскопічне) - вивчення за допомогою мікроскопа форми і будови мікроорганізмів;
- бактеріологічне - вивчення культур мікроорганізмів шляхом культивування, тобто вирощування на штучних поживних середовищах;
- експериментальне - визначення мікроорганізмів і їх отрут шляхом заражень ними піддослідних тварин (мишей, білих щурів, морських свинок). Найчастіше використовується для ідентифікації збудника харчових отруєнь;
- серологічне - визначення мікроорганізмів за допомогою сироватки крові, що містить антитіла. Цей метод широко використовується в медичній мікробіології.
При мікробіологічному аналізі харчових продуктів застосовуються перші два види досліджень. Методом бактеріологічного дослідження визначають культуральні ознаки (розмір, форму, структуру, колір, блиск, профіль окремої колонії) і біохімічні особливості мікроорганізмів (здатність зброджувати речовина, що входить до складу різних поживних середовищ). При бактеріоскопічному дослідженні визначають морфологічні особливості (розмір, форму і т.д.) окремих мікроорганізмів і їх здатність забарвлюватися різними барвниками (тинкторіальних властивості). Оскільки в природі існує багато мікробів-двійників, схожих за зовнішнім виглядом один на одного, тому для визначення виду мікроорганізмів однієї бактеріоскопії зазвичай недостатньо, необхідно застосування бактеріологічного методу дослідження.
- Які правила роботи в лабораторії мікробіології?
При роботі в мікробіологічній лабораторії слід дотримуватися таких правил:
а) перебувати в приміщенні лабораторії і працювати в ній обов'язково в халаті;
б) користуватися постійним робочим місцем;
в) стежити за порядком на робочому місці, не тримати на ньому ніяких сторонніх предметів;
г) пінцети, шпателі, мікробіологічні петлі і голки, піпетки після роботи з мікроорганізмами марнувати в полум'ї спиртівки або занурювати в посудину з дезинфікуючим розчином (хлорамін, Дізол, карболова кислота);
д) всі використані матеріали з мікроорганізмами - відпрацьовані препарати з живих культур, тимчасові препарати і ін. - спочатку знешкодити стерилізацією або дезінфекцією і тільки після цього мити;
е) після закінчення занять привести в порядок робоче місце, зняти халати, і після цього обов'язково вимити руки.
В лабораторії забороняється:
а) перебувати в головних уборах і верхньому одязі;
б) працювати без халатів;
в) приймати їжу, пити воду, палити;
г) класти на столи сторонні предмети;
д) стосуватися немитими руками обличчя;
е) уникати зайвого ходіння, різких рухів, протягів, що сприяють забрудненню досліджуваного матеріалу сторонньої мікрофлорою.
5) Опишіть пристрій біологічного иммерсионного мікроскопа.
Величина більшості мікроорганізмів вимірюється мікронами, або мікрометрами (1 мкм \u003d 1? 10 -6 і \u003d 1? 10 -3 мм), тому розглянути і вивчити їх можна тільки за допомогою спеціальних оптичних приладів - мікроскопів.
Принцип роботи біологічного иммерсионного мікроскопа полягає в отриманні дійсного зворотного зображення предмета в поточному або штучному світлі.
У мікроскопі розрізняють три частини - механічну, оптичну і освітлювальну (див. Рис.1).
Механічна частина, або штатив, складається з опорної частини - підстави мікроскопа 1 і тубусодержатель 2, на якому укріплені предметний столик 3, кронштейн конденсора 4 і дзеркало (або освітлювач) 5, а у верхній частині - головка 6, похилий тубус 7 і револьвер 8 з об'єктивами.
Предметний столик служить для закріплення на ньому розглянутого предмета (препарату), він може переміщатися в горизонтальній площині за допомогою гвинтів 9.
малюнок 2 Мікроскоп «Биолам Р 1У4.2»
Фокусування препарату досягається переміщенням тубуса з допомогою механізму, який приводиться в рух двома гвинтами - макрометріческім 10 (груба фокусування) і мікрометричним 11 (тонка фокусування). Одним оборотом мікрометричного гвинта тубус пересувається на 0,1 мм. При обертанні гвинтів за годинниковою стрілкою тубус мікроскопа опускається, при обертанні проти годинникової стрілки - піднімається.
Увага! Мікрометричний гвинт - одна з найбільш тендітних частин мікроскопа і поводитися з ним треба найбільш обережно!
Оптична частина мікроскопа представлена \u200b\u200bоб'єктивами 12 і окуляром 13.
Об'єктив - це основна частина мікроскопа. Він складається з системи лінз, укладених в металеву оправу. Збільшення об'єктива залежить від фокусної відстані передній (фронтальної) лінзи - єдиною лінзи, що дає збільшення. Чим більше кривизна фронтальної лінзи, тим коротше фокусна відстань і тим більше збільшення об'єктива. Розташовані над нею кореляційні лінзи призначені для отримання більш чіткого зображення (усунення дефектів зображення - сферичної і хроматичної аберацій). Збільшення, яке дають об'єктиви, зазначено цифрами на їх оправі.
Залежно від ступеня дається збільшення об'єктиви діляться на об'єктиви малого, середнього і великого збільшень.
6) Як визначається загальне збільшення мікроскопа?
Загальне збільшення мікроскопа визначається твором збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Наприклад, якщо збільшення об'єктива 90 х, а окуляра 15 х, то загальне збільшення дорівнює 1350 х.
Освітлювальний пристрій розташовано під предметним столиком. Його призначення - освітлення поля зору препарату. В освітлювальному пристрої розрізняють дзеркало, або освітлювач, і конденсор з ірисовою діафрагмою 14.
Конденсор представляє собою систему сильних лінз і служить для посилення яскравості освітлення даного об'єкту. Він збирає відбиті від дзеркала промені світла в пучок і концентрує їх в площині препарату. Пересувається конденсор в вертикальному напрямку за допомогою гвинта 15. При опусканні конденсора поле зору мікроскопа затемнюється, при піднятті - висвітлюється.
Діафрагму розташована під конденсором. Вона складається з тонких металевих сегментів, які за допомогою важеля можна зрушувати або розсовувати, регулюючи цим надходження світла в конденсор.
7) Що таке сухі і імерсійним об'єктиви?
Об'єктиви малого збільшення (3 х, 5 х, 8 х, 9 х, 10 х) застосовують головним чином для попереднього огляду препарату. Об'єктиви середнього збільшення (20 х, 40 х, 60 х) - для вивчення великих клітин мікроорганізмів (наприклад, грибів). Ці об'єктиви називають сухими, оскільки при мікроскопії між фронтальною лінзою і препаратом знаходиться повітря. Внаслідок відмінності показників заломлення повітря (n \u003d 1) і скла (n \u003d 1,52) частина променів, які висвітлюють препарат, розсіюється і залишається поза увагою.
Об'єктиви великих збільшень (85 х, 90 х) називаються імерсійними. Їх застосовують для вивчення дрібних форм мікроорганізмів (наприклад, бактерій). При роботі з ними препарат повинен бути максимально освітлений. Светорассеіваніе, неминуче при роботі з об'єктивами, в даному випадку усувається завдяки використанню іммерсійних рідин, показник заломлення яких близький до показника заломлення скла. Найчастіше використовують кедрове масло, у якого n \u003d 1,515. Краплю рідини наносять на препарат і занурюють в неї об'єктив. Коротке фокусна відстань об'єктивів великого збільшення ((1,9 - 2,1) мм) дозволяє досліджувати об'єкт, не піднімаючи об'єктив з краплі, внаслідок чого створюється однорідне середовище між лінзою і препаратом.
Окуляр складається з двох лінз, укладених в загальну металеву оправу. Верхня лінза називається очної, нижня - збиральної. Окуляр лише збільшує зображення, що дається об'єктивом. Мікроскопи системи «Биолам» забезпечені окулярами, що дають збільшення 7 х, 10 х і 15 х (цифри вказані на оправі).
8) Що означає поняття «роздільна здатність» мікроскопа? Яка роздільна здатність мікроскопа серії «Биолам»?
Основною технічною характеристикою мікроскопа є роздільна здатність - тобто мінімальна відстань між двома точками розглянутого предмета, на якому вони не зливаються в одну і предмет видно чітко. У лабораторній практиці найбільш широко використовуються біологічні імерсійним мікроскопи серії «Биолам», що дозволяють отримати збільшення об'єкта до 1800 разів. Їх гранична роздільна здатність дорівнює 0,21 мкм, отже, користуючись цими мікроскопами, можна розглядати об'єкти величиною не менше 0,21 мкм.
9) Які правила мікроскопії препарату?
Мікроскопію препаратів завжди починають з установки світла. При роботі в денний час користуються природним освітленням, однак частіше вдаються до джерел штучного світла, які забезпечують регульоване освітлення (освітлювачі ОІ-19, ОІ-35).
При установці світла конденсор повинен бути піднятий до упору, ірисова діафрагма відкрита. Налаштування освітлення проводиться за об'єктивом малого збільшення (8 х). Його опускають на відстань близько 0,5 см від предметного столика, потім, дивлячись в окуляр і обертаючи дзеркало, домагаються рівномірного яскравого освітлення всього поля зору.
Приготований препарат поміщають на предметний столик, зміцнюють клемами. Мікроскопію починають з оглядового перегляду препарату при малому збільшенні. При цьому, спостерігаючи збоку, опускають об'єктив за допомогою макрометріческого гвинта на відстань близько 1 см від предметного столика. Дивлячись в окуляр, і повільно обертаючи макроскопічний гвинт, піднімають тубус до появи виразних контурів препарату. Для точного фокусування користуються мікрометричним гвинтом, який обертають не більше ніж на чверть обороту. На цьому етапі при дослідженні бактерій можна, повільно пересуваючи препарат на предметному столику, знайти найбільш підходяще для мікроскопії поле зору: ділянку препарату, на якому мікроорганізми перебувають в достатній для перегляду кількості, розташовуються в один шар, рівномірно.
При мікроскопії із середнім збільшенням замінюють об'єктив малого збільшення на об'єктиви 40 х або 60 х. Про з центром положенні об'єктиву свідчить клацання фіксатора всередині револьвера. Дивлячись в окуляр, ще більш повільно піднімають тубус до появи зображення і уточнюють фокус мікрометричним гвинтом.
Мікроскопія при великому збільшенні (об'єктив 90 х) проводиться з іммерсійним маслом, краплю якого наносять на препарат. Потім замінюють сухий об'єктив на іммерсійний, під контролем ока (вид збоку) занурюючи його в масло майже до зіткнення фронтальної лінзи з предметним склом. Дивлячись в окуляр, макрометріческім гвинтом злегка піднімають тубус до появи зображення препарату, а потім за допомогою мікроскопічного гвинта домагаються його фокусування.
Після закінчення роботи піднімають тубус, знімають з предметного столика препарат, опускають конденсор і ретельно видаляють сухою бавовняною серветкою масло з фронтальним лінзи иммерсионного об'єктива. Залишки иммерсионного масла можуть пошкодити лінзу і погіршити зображення при мікроскопії.
При мікроскопії можливі такі помилки:
- неповне висвітлення поля зору внаслідок неправильного положення дзеркала або неправильного положення об'єктива (перенесуть на револьвері мікроскопа не до клацання);
- тьмяне освітлення поля зору при неправильному положенні дзеркала, при опущеному конденсорі або закритій діафрагмі, а також при недостатній кількості иммерсионного масла на препараті;
- відсутність різкості в зображенні предмета - препарат не в фокусі.
висновок: Ознайомилися з призначенням, пристроєм, обладнанням і режимом роботи мікробіологічної лабораторії; освоїли техніку мікроскопії мікробіологічних препаратів.
Міністерство освіти Республіки Білорусь
Заклад освіти
МОГИЛЕВСЬКИЙ державний університет продовольства
КАФЕДРА «ТЕХНОЛОГІЇ ХАРЧОВИХ ВИРОБНИЦТВ»
Лабораторна робота №2
Спеціальність 1-25010901 «Товарознавство та експертиза продовольчих товарів»
перевірив
ст.викладач
____________ Тітенкова Н. І.
«__» _________ 2011
виконала
Студентка групи ТЕТ-101
____________ Лобкова М. Ю.
«__» _________ 2011
Могильов 2011
Міністерство освіти Республіки Білорусь
Заклад освіти
МОГИЛЕВСЬКИЙ державний університет продовольства
КАФЕДРА «ТЕХНОЛОГІЇ ХАРЧОВИХ ВИРОБНИЦТВ»
Вивчення морфології бактерій, зустрічаються в харчовій
промисловості. Правила роботи з культурами мікроорганізмів
Лабораторна робота №2
Спеціальність 1-25010901 «Товарознавство та експертиза продовольчих товарів»
перевірив
ст.викладач
____________ Тітенкова Н. І.
«__» _________ 2011
виконала
Студентка групи ТЕТ-101
____________ Шевцова Е. Н.
«__» _________ 2011
Могильов 2011
Лабораторна робота № 2.
Вивчення морфології бактерій, зустрічаються в харчовійпромисловості. Правила роботи з культурами мікроорганізмів
мета: Ознайомлення з морфологією бактерій, часто зустрічаються в харчовій промисловості, і методами її вивчення під мікроскопом в прижиттєвих і фіксованих забарвлених препаратах; ознайомлення з правилами поводження з культурами мікроорганізмів.
Матеріали та обладнання: мікроскоп, предметні скельця з луночками і без них, покривні скла, спиртівки, розчини барвників, мікробіологічні петлі, іммерсійне масло, чисті культури бактерій.
ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА
Приготували фіксовані препарати, пофарбували їх за методом Грама і розглянули з іммерсійним об'єктивом. Розрахували загальне збільшення мікроскопа: 90 х х15 х \u003d 1350 х.
В результаті отримали наступне:
мікрококи, гр (+)
стафілококи, гр (+)
палички, гр (+)
Контрольні питання:
- Правила роботи з культурами мікроорганізмів.
При приготуванні препаратів мікроорганізмів, а також при їх посівах і пересіву необхідно суворо дотримуватися правил і порядок роботи. Всі роботи з культурами мікроорганізмів необхідно проводити в полум'ї спиртівки. З живильного середовища мікроорганізми беруться мікробіологічної петлею, яка попередньо обпалюють (фламбіруйте) в полум'ї спиртівки.
Порядок роботи повинен бути наступним:
Запалити спиртівку.
Взяти пробірку з культурою і помістити її так, щоб вона перебувала між великим і вказівним пальцем лівої руки, підтримувалася середнім пальцем і перебувала в похилому положенні.
Взяти правою рукою мікробіологічну петлю, прожарити її в полум'ї спиртівки, тримаючи вертикально.
Правою рукою, щільно затиснувши ватяну пробку між мізинцем і долонею, обертальним рухом повернути пробку, вийняти її з пробірки і тримати кінцем вниз, стежачи за тим, щоб вона не стосувалася навколишніх предметів.
Обпалити краю пробірки.
Ввести остигнула петлю в пробірку і взяти невелику кількість мікробної маси, злегка торкаючись до культури і не дряпаючи щільне ПС петлею. Якщо мікроорганізми вирощені в рідкому поживному середовищі, то береться петлею крапля рідини.
Знову обпалити в полум'я пальника краю пробірки, частина ватяною пробки і закрити пробірку пробкою.
Взятий матеріал емульгувати в наявній на предметному склі краплі води і рівномірно тонким шаром розподілити по поверхні (готують мазок).
Знову обпалити петлю в полум'я, щоб знищити залишилися в ній мікроорганізми.
- Як приготувати препарати для прижиттєвої мікроскопії мікробів? Які переваги та недоліки цього методу?
1 Препарат «висяча крапля». Невелику краплю суспензії мікробних клітин наносять на покривне скло і обережно накладають на нього предметне скло так, щоб крапля вільно поміщалася в центрі поглиблення. Краї луночек попередньо змащують вазеліном, препарат перевертають і проводять мікроскопію. Цей метод застосовують, головним чином, для вивчення рухливості мікроорганізмів.
2 Препарат «роздавлена \u200b\u200bкрапля» незабарвлений (нативний). На предметне скло наносять краплю рідини (при роботі з бактеріями - водопровідну воду, при роботі з мікроскопічними грибами - суміш рівних обсягів етилового спирту і гліцерину), вносять в неї трохи досліджуваних мікроорганізмів, розмішують і накривають покривним склом, обережно накладаючи його по ребру щоб уникнути утворення бульбашок. Надлишок виступила рідини видаляють фільтрувальної папером. Вирощені на щільному живильному середовищі бактерії переносять в краплю рідини за допомогою бактеріологічної голки, а мікроскопічні гриби - двома препаровальной голками. Культура, вирощена в рідкому середовищі, наприклад, дріжджі, поміщається на предметне скло стерильною піпеткою без попереднього нанесення краплі рідини. Мікроскопують препарат сухими об'єктивами. Препарат дозволяє встановити форму клітин переважно великих мікроорганізмів, їх розміри, розташування, рухливість.
3 Препарат «роздавлена \u200b\u200bкрапля» прижиттєво забарвлених мікроорганізмів. До краплі мікробної суспензії на предметному склі додають краплю слабкого розчину (1: 1000) барвника (метиленового синього або фуксину), розмішують, потім накривають покривним склом.
і т.д.................
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
до лабораторного практикуму з дисципліни «Загальна біологія та мікробіологія» для студентів напряму 240700.62 «Біотехнологія»
Москва 2013
Вступ
Методичні вказівки призначені для студентів, які навчаються за напрямом 240700.62 «Біотехнологія» та містять тематику лабораторних занять, мета яких прищепити студентам навички роботи в лабораторії з мікроорганізмами, вивчити їх морфологію і фізіологічні властивості, освоїти методи мікробіологічних робіт. Як об'єкти дослідження при виконанні робіт використовуються чисті культури мікроорганізмів - продуценти біологічно активних речовин.
Завданнями методичних вказівок є:
Ознайомлення студентів з обладнанням мікробіологічної лабораторії і способами стерилізації поживних середовищ, посуду, інвентарю;
Освоєння студентами техніки виділення чистих культур;
Вивчення студентами морфологічних і культуральних ознак найважливіших груп мікроорганізмів;
Освоєння студентами методів кількісного обліку мікроорганізмів, в тому числі і в харчових продуктах.
Правила роботи при виконанні мікробіологічного практикуму. Техніка безпеки в мікробіологічній лабораторії.
У лабораторію забороняється входити в верхньому одязі і класти на столи особисті речі. У мікробіологічної лабораторії дозволяється працювати тільки в халатах, які захищають одяг від контамінації мікроорганізмами, а також перешкоджають їх поширенню за межі лабораторії. Волосся необхідно заколювати.
За кожним студентом закріплюється постійне робоче місце, яке повинно підтримуватися в постійному порядку.
На всіх пробірках, чашках Петрі, колбах обов'язково пишеться назва мікроорганізму, дата його посіву, прізвище студента, номер групи.
В ході роботи бактеріологічні петлі і голки знезаражуються прокаливанием в полум'я пальника до і після відбору мікроорганізмів. Готуючи препарат або виробляючи пересівши культур мікроорганізмів, які виросли на рідкому середовищі, користуються не петлею, а піпеткою, в верхній кінець якої повинен бути вкладений шматочок вати, щоб не допустити випадкового зіткнення мікробного матеріалу з порожниною рота. Використані шпателі, піпетки поміщаються в порцелянові склянки з дезінфікуючими розчинами, сірники, фільтрувальну папір, відпрацьовані препарати поміщають в кристалізатор. Зазначені предмети класти на стіл категорично забороняється.
У разі потрапляння досліджуваного матеріалу або культури мікроорганізму на руки, стіл, халат або взуття необхідно повідомити про це викладачеві і під його керівництвом провести дезінфекцію.
Після закінчення заняття робоче місце дезінфікується, використаний матеріал та інші предмети знешкоджуються, руки миються з милом, приміщення провітрюють і, по можливості, стерилізують за допомогою УФ-ламп.
Пристрій мікроскопа. Препарати для микроскопирования.
Мікроскоп. Основні правила микроскопирования.
Вивчення морфології і будови клітин мікроорганізмів, величини яких вимірюються мікрометрами, нанометрами, Ангстрема, можливо тільки за допомогою мікроскопів. У лабораторних умовах найчастіше використовується світлова мікроскопія.
Мікроскоп має механічну і оптичну частини (рис.1). механічна частина включає штатив, предметний столик, тубус з револьверною голівкою, макро- і мікрометричні гвинти. Нижня частина штатива є опорою мікроскопа, верхня - тубусодержатель, який може переміщатися за допомогою механізму, що приводиться в дію обертанням макрометріческого і мікрометричного гвинтів, призначених для грубої і тонкої фокусування препарату відповідно. При обертанні гвинтів за годинниковою стрілкою тубусодержатель мікроскопа опускається, проти - піднімається. У верхній частині тубусодержатель знаходиться обертається навколо своєї осі револьвер. В отвори нижньої пластини револьвера угвинчені об'єктиви. У верхній кінець тубуса вкладаються змінні окуляри. Предметний столик круглої або прямокутної форми служить для розміщення на ньому препарату, має в центрі отвір для проходження променів, які висвітлюють препарат. Рухомий столик можна пересувати в горизонтальній площині за допомогою двох гвинтів, що знаходяться праворуч і ліворуч. Це дозволяє помістити будь-яку точку препарату в центр поля зору. На поверхні столика знаходяться два затиску для закріплення препарату. У разі нерухомого предметного столика, є гніздо для препаратоводієм, в яке він зміцнюється (рис 1).
Мал. 1. Схема мікроскопа "Биолам": 1 - окуляр; 2 - бінокулярна насадка; 3 - револьверний пристрій; 4 - об'єктив; 5 - предметний столик; 6 - конденсор; 7 - корпус колекторної лінзи; 8 - патрон з лампою; 9 - шарнір; 10 - рукоятка переміщення кронштейна конденсора; 11 - мікрогвинт; 12 - макровінт; 13 - тубусодержатель; 14 - гвинт для кріплення насадки; 15 - індикатор; 16 - вимикач.
оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарату, об'єктива і окуляра. Освітлювальна частина мікроскопа складається з розташованих під предметним столиком конденсора і вбудованого освітлювача з низьковольтної лампою розжарювання. Конденсор представляє собою оптичну систему з двох лінз: плосковипуклой (верхньої) і двоопуклою (нижньої). Конденсор концентрує паралельні промені, що йдуть від джерела світла, в одній точці, фокусі, який повинен знаходитися в площині препарату. Конденсор спеціальним гвинтом, розташованим під предметним столиком, переміщається вгору і вниз. Під конденсором є ірисова діафрагма і відкидна оправа для світлофільтру. Діафрагму служить для затримання зайвих променів світла і дозволяє при необхідності зменшити апертуру конденсора (охоплення лінзи; характеризується кількістю променів, що потрапляють в лінзу). Лінзи конденсора разом з ірисовою діафрагмою вмонтовані в циліндричну оправу.
Об'єктив являє собою найбільш важливу частину мікроскопа. Він складається з системи лінз, укладених в металеву оправу, які дають дійсне збільшене зворотне зображення. Зовнішня лінза, звернена до предмету, називається фронтальною, це основна і єдина в об'єктиві лінза, що дає збільшення. Вище фронтальної розташовуються корекційні лінзи. Вони мають різну кривизну і виготовляються зі скла різної оптичної щільності. Корекційні лінзи призначені для усунення похибок і отримання більш чіткого зображення.
Мікроскопи постачають знімними об'єктивами з власним збільшення 8 х, 40 х і 90 х (100 х), позначеними на металевій оправі. Збільшення об'єктива залежить від фокусної відстані фронтальної лінзи і від її кривизни. Чим більше кривизна фронтальної лінзи, тим коротше фокусна відстань і тим більше збільшення об'єктива. Тому чим більше збільшення дає об'єктив, тим нижче його слід опускати над площиною препарату.
Окуляр служить для розгляду зображення об'єкта, збільшеного за допомогою об'єктива, і містить дві лінзи: очну (верхню) і збірну (нижню). Мікроскопи постачають окулярами зі збільшенням в 5, 7, 10, 12, 15 і 20 разів, що вказано на їх оправі (5 х, 7 х, 10 х, 12 х, 15 х і 20 х). Розрізняють моно- і бінокулярні мікроскопи.
загальне збільшення, Яке дає мікроскоп, визначається твором збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Однак загальне збільшення ще не характеризує всіх можливостей мікроскопа. Збільшене зображення може виявитися як чітким, так і нечітким. Виразність одержуваного зображення визначається роздільною здатністю мікроскопа - мінімальним відстанню між двома точками, коли вони ще не зливаються в одну. Чим більше роздільна здатність мікроскопа, тим менші за розміром об'єкт можна побачити.
Мікроскопічний об'єкт можна розглядати в трьох типах системи: сухий - між лінзою об'єктива і об'єктом знаходиться повітря; водної - між лінзою об'єктива і об'єктом знаходиться крапля води - водна іммерсія; масляної - лінза об'єктива занурена в краплю иммерсионного масла - кедрового, касторової, вазелінового - масляна іммерсія.
Мікроскоп - це оптичний прилад, що дозволяє отримати зворотне зображення досліджуваного об'єкта і розглянути дрібні деталі його будови, розміри яких лежать за межами роздільної здатності ока.
Роздільна здатністьмікроскопа дає роздільне зображення двох близьких один одному ліній. Неозброєний людське око має роздільну здатність близько 1/10 мм або 100 мкм. Кращий світловий мікроскоп приблизно в 500 разів покращує можливість людського ока, т. Е. Його роздільна здатність становить близько 0,2 мкм або 200 нм.
Роздільна здатність і збільшення не одне і теж. Якщо за допомогою світлового мікроскопа отримати фотографії двох ліній, розташованих на відстані менше 0,2 мкм, то, як би не збільшувати зображення, лінії будуть зливатися в одну. Можна отримати велике збільшення, але не поліпшити його дозвіл.
розрізняють кориснеі марне збільшення. Під корисним розуміють таке збільшення об'єкта, що спостерігається, при якому можна виявити нові деталі його будови. Марне - це збільшення, при якому, збільшуючи об'єкт в сотні і більше разів, не можна виявити нових деталей будови. Наприклад, якщо зображення, отримане за допомогою мікроскопа, збільшити ще в багато разів, спроектувавши його на екран, то нові, більш тонкі деталі будови при цьому не виявляться, а лише відповідно збільшаться розміри наявних структур.
В навчальних лабораторіях зазвичай використовують світлові мікроскопи, На яких мікропрепарати розглядаються з використанням природного або штучного світла. найбільш поширені світлові біологічні мікроскопи:БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (мікроскоп біологічний робочий), МБІ (мікроскоп біологічний дослідний) і МБС (мікроскоп біологічний стереоскопічний). Вони дають збільшення в межах від 56 до 1350 разів. стереомикроскоп(МБС) забезпечує справді об'ємне сприйняття мікрооб'єкту і збільшує від 3,5 до 88 разів.
У мікроскопі виділяють дві системи: оптичнуі механічну.До оптичній системівідносять об'єктиви, окуляри і освітлювальний пристрій (конденсор з діафрагмою і світлофільтром, дзеркало або електроосвітлювач).
Пристрій світлових мікроскопів зображено на рис. 1.
Мал. 1. Пристрій світлових мікроскопів:
А - МИКМЕД-1; Б - БИОЛАМ.
1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - гвинт грубої наводки, 5 - мікрометренний гвинт, 6 - підставка, 7 - дзеркало, 8 - конденсор, ірисова діафрагма і світлофільтр, 9 - предметний столик, 10 - револьверний пристрій, 11 - об'єктив, 12 - корпус колекторної лінзи, 13 - патрон з лампою, 14 - джерело електроживлення.
об'єктив -одна з найважливіших частин мікроскопа, оскільки він визначає корисне збільшення об'єкта.Об'єктив складається з металевого циліндра з вмонтованими в нього лінзами, число яких може бути різним. Збільшення об'єктива позначено на ньому цифрами. У навчальних цілях використовують зазвичай об'єктиви х8 і х40. Якість об'єктива визначає його роздільна здатність.
окулярвлаштований набагато простіше об'єктива. Він складається з 2-3 лінз, вмонтованих в металевий циліндр. Між лінзами розташована постійна діафрагма, яка визначає межі поля зору. Нижня лінза фокусує зображення об'єкта, побудоване об'єктивом в площині діафрагми, а верхня служить безпосередньо для спостереження. Збільшення окулярів позначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляри не виявляється нових деталей будови, і в цьому відношенні їх збільшення марно. Таким чином, окуляр, подібно лупи, дає пряме, уявне, збільшене зображення об'єкта, що спостерігається, побудоване об'єктивом.
Для визначення загального збільшення мікроскопаслід помножити збільшення об'єктива на збільшення окуляра.
освітлювальний пристрійскладається з дзеркала або Електроосвітлювал, конденсора з ірисовою діафрагмою і світлофільтром, розташованих під предметним столиком. Вони призначені для освітлення об'єкта пучком світла.
Люстеркослужить для направлення світла через конденсор і отвір предметного столика на об'єкт. Воно має дві поверхні: плоску і увігнуту. У лабораторіях з розсіяним світлом використовують увігнуте дзеркало.
Електроосвітлювалвстановлюється під конденсором в гніздо підставки.
конденсорскладається з 2-3 лінз, вставлених в металевий циліндр. При підйомі або опусканні його за допомогою спеціального гвинта відповідно конденсується або розсіюється світло, що падає від дзеркала на об'єкт.
Діафрагмурозташована між дзеркалом і конденсором. Вона служить для зміни діаметра світлового потоку, що направляється дзеркалом через конденсор на об'єкт, відповідно до діаметра застосованого фронтальної лінзи об'єктива і складається з тонких металевих пластинок. За допомогою важеля їх можна якось поєднати, повністю закриваючи нижню лінзу конденсора, то розвести, збільшуючи потік світла.
Кільце з матовим скломабо світлофільтромзменшує освітленість об'єкта. Воно розташоване під діафрагмою і пересувається в горизонтальній площині.
механічна системамікроскопа складається з підставки, коробки з мікрометренним механізмом і мікрометренним гвинтом, тубуса, тубусодержатель, гвинта грубої наводки, кронштейна конденсора, гвинта переміщення конденсора, револьвера, предметного столика.
Підставка- це підстава мікроскопа.
Коробка з мікрометренним механізмом, Побудованому на принципі взаємодіючих шестерень, прикріплена до підставки нерухомо. Мікрометренний гвинт служить для незначного переміщення тубусодержатель, а, отже, і об'єктива на відстані, що вимірюються мікрометрами. Повний оборот мікрометренного гвинта пересуває тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одну поділку опускає або піднімає тубусодержатель на 2 мкм. Щоб уникнути псування мікрометренного механізму дозволяється крутити мікрометренний гвинт в одну сторону не більше ніж на половину обороту.
тубусабо трубка- циліндр, в який зверху вставляють окуляр. Тубус рухомо з'єднаний з головкою тубусодержатель, його фіксують стопорним гвинтом в певному положенні. Послабивши гвинт, тубус можна зняти.
револьверпризначений для швидкої зміни об'єктивів, які вгвинчуються в його гнізда. Центрированное положення об'єктива забезпечує засувка, розташована всередині револьвера.
Гвинт грубої наводкивикористовують для значного переміщення тубусодержатель, а, отже, і об'єктива з метою фокусування об'єкта при малому збільшенні.
предметний столикпризначений для розташування на ньому препарату. В середині столика є круглий отвір, в яке входить фронтальна лінза конденсора. На столику є дві пружні клеми - затискачі, що закріплюють препарат.
кронштейн конденсорарухомо приєднаний до коробки мікрометренного механізму. Його можна підняти або опустити за допомогою гвинта, що обертає зубчасте колесо, що входить в пази рейки з гребенчатой \u200b\u200bнарізкою.
Для дослідження дріжджів, бактерій і цвілевих грибів застосовують мікроскопи, призначені для розгляду прозорих препаратів в світлі (рис. 8).
Оптична частина мікроскопа. Основною частиною оптичної системи мікроскопа є об'єктив, що збільшує зображення предмета. Він складається з ряду лінз, склеєних канадським бальзамом і укладених в металеву трубку; на трубці є різьблення, за допомогою якої об'єктив угвинчується в спеціальне гніздо револьвера.
Зображення, що дається об'єктивом, розглядають за допомогою окуляра, що знаходиться у верхній частині тубуса мікроскопа. Біологічні мікроскопи забезпечуються трьома змінними окулярами. На верхній оправі окуляра вказано його збільшення. Зазвичай окуляри дають збільшення в 7, 10 і 15 разів. Загальне збільшення об'єкта мікроскопом дорівнює добутку збільшення окуляра на збільшення об'єктива \u003d 900 раз.
Освітлювальний пристрій розташовується під столиком мікроскопа і складається з конденсора з ірис-діафрагмою і дзеркала.
Механічна частина мікроскопа. Ця частина складається з штатива, тубусодержатель з револьвером, гвинтів для пересування тубуса (макрометріческого і мікрометричного), освітлювального апарату і предметного столика мікроскопа. Основними частинами штатива є нижня підставка (ніжка), що надає мікроскопу стійкість, і тубусодержатель мікроскопа.
техніка микроскопирования. Перш ніж почати мікроскопірованіе, необхідно встановити правильне освітлення. Для цього з мікроскопа знімають окуляр і, дивлячись прямо в об'єктив, встановлюють дзеркало так, щоб джерело світла (лампа або вікно) були видні посередині об'єктива. Після попередньої установки світла на предметний столик мікроскопа кладуть готовий препарат і закріплюють його зажимами. За допомогою макрометріческого гвинта опускають тубус майже до зіткнення з покривним склом. Потім, дивлячись в окуляр, поступово піднімають тубус до появи зображення. Для наведення різкості користуються мікрометричним гвинтом.
При мікроскопіраваніі слід тримати обидва ока відкритими. Дивляться в мікроскоп лівим оком.
Техніка приготування препарату для микроскопирования. Краплю досліджуваної рідини наносять на чисте предметне скло і обережно накривають покривним склом. Якщо препарат готують з щільного поживного середовища, то на предметне скло наносять крапельку чистої водопровідної води, в неї поміщають досліджувану культуру і препарат накривають покривним склом. Під останнім не повинно залишатися повітряних бульбашок, так як вони заважають мікроскопірованію. Надлишок рідини, який виступає через покривного скла, прибирають фільтрувальної папером, заздалегідь нарізаною невеликими вузькими смужками. Готовий препарат поміщають на предметний столик і досліджують.